Tekoče biopsije za diagnosticiranje raka

Tipično se tumorji pregledajo z uporabo biopsij tkiv. Majhen vzorec se vzame iz tumorja in genotipizira ali analizira za genetsko sestavo. Težava pri tem pristopu je, da so biopsijski tumorji lahko zahtevni. Poleg tega tumorska biopsija zagotavlja le posnetek tumorja.

Pisanje v Discovery Medicine leta 2015 Labgaa in soavtorji navajajo naslednje o konvencionalni biopsiji tumorja:

"Iz očitnih razlogov je težko spremljati evolucijo tumorja z zaporednimi biopsijami. Tudi biopsija odraža le eno točko tumorja in zato ni verjetno, da bi predstavljala celoten spekter somatskih mutacij v velikih tumorjih. biopsije za isti tumor, vendar ta možnost ni niti realistična niti točna."

Tekoča biopsija vključuje merjenje krožeče DNA (ctDNA) in drugih stranskih produktov tumorjev v krvnih vzorcih, ki jih dobijo bolniki z rakom. Ta nastajajoč diagnostični pristop obljublja, da bo hiter, neinvaziven in stroškovno učinkovit.

Zgodovina tekoče biopsije

Leta 1948 so francoski raziskovalci Mandel in Métais najprej odkrili ctDNA v krvi zdravih ljudi. To odkritje je bilo pred svojim časom, in šele desetletja kasneje se je ctDNA še raziskala.

Leta 1977 sta Leon in sodelavci prvič odkrili povečano količino ctDNA v krvi bolnikov z rakom. Do leta 1989 so Stroun in njegovi sodelavci odkrili neoplastične (tj. Rakaste) lastnosti v krvi. Po teh odkritjih je več drugih skupin identificiralo specifične mutacije v tumorskih supresorjih in onkogenih, mikrosatelitni nestabilnosti in metilaciji DNA, kar je dokazalo, da se ctDNA sprosti v krvni obtok preko tumorjev.

Čeprav vemo, da ctDNA, ki izhaja iz tumorskih celic, kroži v krvi, so izvor, hitrost sproščanja in mehanizem sproščanja te DNK nejasni, raziskave pa dajejo nasprotujoče si rezultate. Nekatere raziskave kažejo, da več malignih tumorjev vsebuje več mrtvih rakavih celic in sprošča več ctDNA. Vendar pa nekatere raziskave kažejo, da vse celice sproščajo ctDNA. Kljub temu se zdi verjetno, da rakasti tumorji sproščajo zvišane ravni ctDNA v kri, zaradi česar je ctDNA dober biomarker raka.

Zaradi velike fragmentacije in nizkih koncentracij v krvi je ctDNA težko izolirati in analizirati. Koncentracije ctDNA med vzorci seruma in plazme se razlikujejo.Zdi se, da je krvni serum namesto krvne plazme boljši vir ctDNA. V študiji Umetani in sodelavcev so ugotovili, da so koncentracije ctDNA v plazmi v primerjavi s serumom dosledno nizke zaradi možne izgube krožeče DNA med čiščenjem, saj se pri pripravi vzorcev izločajo koagulacija in drugi proteini.

Heitzer in njegovi sodelavci menijo, da je tu nekaj specifičnih vprašanj, ki jih je treba rešiti, da bi lahko uporabili diagnostični potencial ctDNA:

"Najprej je treba standardizirati predanalitske postopke …. Izbira metode izolacije, ki zagotavlja ekstrakcijo zadostne količine visoko kakovostne DNK, je ključnega pomena in dokazano je, da lahko predanalitični dejavniki vzorčenja in obdelave krvi močno vplivajo na donos DNK." Drugič, eno od najpomembnejših vprašanj je pomanjkanje usklajenosti metod kvantifikacije, različne metode kvantifikacije, … povzročajo različne rezultate, ker so te meritve namenjene bodisi skupni bodisi samo ojačeni DNA… Tretjič, manj je znanega o izvoru in podrobnih podatkih. mehanizmom sproščanja ctDNA in v večini študij zmedeni dogodki, ki bi lahko prispevali tudi k sproščanju ctDNA."

Ciljni in neciljani pristopi

Pri analizi krvne plazme (ali seruma) ctDNA se trenutno uporabljata dva glavna pristopa. Prvi pristop je usmerjen in išče specifične genetske spremembe, ki kažejo na tumorje. Drugi pristop je neusmerjen in vključuje analizo celotnega genoma, ki išče ctDNA, ki odraža raka. Druga možnost je, da je sekvenciranje exome uporabljeno kot bolj stroškovno učinkovit in neusmerjen pristop. Eksomi so deli DNK, ki so prepisani, da bi dobili beljakovino.

S ciljnimi pristopi se analizira serum za znane genetske mutacije v majhnem številu mutacij voznika. Mutacije voznika se nanašajo na mutacije v genomu, ki spodbujajo ali "poganjajo" rast rakavih celic. Te mutacije vključujejo KRAS ali EGFR.

Zaradi tehnološkega napredka v zadnjih letih so ciljni pristopi k analizi genoma za majhne količine ctDNA postali izvedljivi. Te tehnologije vključujejo ARMS (amplification refractory mutation system); digitalni PCR (dPCR); kroglice, emulzije, ojačanje in magnetne lastnosti (BEAMing); in globoko sekvenciranje (CAPP-Seq).

Čeprav je bil dosežen napredek v tehnologiji, ki omogoča ciljno usmerjen pristop, ciljni pristop cilja le na nekaj položajev mutacij (vročih točk) in zgreši veliko vozniških mutacij, kot so tumor supresorski geni.

Glavna prednost neciljanih pristopov k tekoči biopsiji je, da se lahko uporabljajo pri vseh bolnikih zaradi dejstva, da test ne temelji na ponavljajočih se genetskih spremembah. Ponavljajoče se genetske spremembe ne zajemajo vseh vrst raka in niso specifični znaki raka. Kljub temu ta pristop nima analitične občutljivosti in celostne analize tumorskih genomov še ni mogoče.

Opozoriti je treba, da je cena sekvenciranja celotnega genoma znatno padla. Leta 2006 je bila cena sekvenciranja celotnega genoma približno 300.000 USD (USD). Do leta 2017 so se stroški znižali na približno 1.000 USD (USD) na genom, vključno z reagenti in amortizacijo strojev za določanje sekvenc.

Klinična koristnost tekoče biopsije

Začetna prizadevanja za uporabo ctDNA so bila diagnostična in primerjala ravni pri zdravih bolnikih z bolniki z rakom ali bolniki z benigno boleznijo. Rezultati teh prizadevanj so bili mešani, le nekatere študije so pokazale pomembne razlike, ki kažejo na rak, stanje brez bolezni ali ponovitev bolezni.

Razlog, zakaj se ctDNA lahko uporablja le nekaj časa za diagnosticiranje raka, je v tem, da iz tumorjev izhajajo variabilne količine ctDNA. Vsi tumorji "ne odtečejo" DNK v isti količini. Na splošno so naprednejši, razširjeni tumorji izgubili več DNK v krvnem obtoku kot zgodnji, lokalizirani, tumorji. Poleg tega različne vrste tumorjev v krvni obtok odstopajo različne količine DNA. Delež krožeče DNA, ki izhaja iz tumorja, je zelo različen med študijami in tipi raka, ki segajo od 0,01% do 93%. Pomembno je omeniti, da je na splošno le manjšina ctDNA pridobljena iz tumorja, preostali del pa iz normalnih tkiv.

Cirkulacijsko DNA bi lahko uporabili kot prognostični marker bolezni. Cirkulacijsko DNA bi lahko uporabili za spremljanje sprememb v raku skozi čas. Na primer, ena študija je pokazala, da je dveletno preživetje pri bolnikih z rakom debelega črevesa in danke (tj. Število bolnikov, ki so še vedno živi vsaj dve leti po diagnozi s kolorektalnim rakom) in KRAS Hotspot mutacije je bilo 100% pri tistih brez dokazov o ustrezni cirkulacijski DNA. Poleg tega je možno, da se lahko v bližnji prihodnosti za spremljanje predrakavih lezij uporabi krožeča DNA.

Za spremljanje odziva na terapijo se lahko uporabi tudi cirkulacijska DNA. Ker kroženje DNK ponuja boljšo splošno sliko o genetski sestavi tumorjev, ta DNK verjetno vsebuje diagnostično DNK, ki jo lahko uporabimo namesto diagnostične DNK, ki jo dosežejo sami tumorji.

Zdaj pa si poglejmo nekaj posebnih primerov tekoče biopsije.

Guardant360

Guardant Health je razvil test, ki uporablja sekvenciranje naslednje generacije za profiliranje krožeče DNA za mutacije in kromosomske preureditve za 73 genov, povezanih z rakom. Guardant Health je objavil študijo, ki poroča o koristnosti tekoče biopsije v onkologiji. V raziskavi so bili uporabljeni vzorci krvi 15.000 bolnikov s skupaj 50 tipi tumorjev.

Večinoma so rezultati testa tekoče biopsije usklajeni z genskimi spremembami, ki so jih opazili v tumorskih biopsijah.

Po podatkih NIH:

"Guardant360 je identificiral enake kritične mutacije v pomembnih genih, povezanih z rakom EGFR, BRAF, KRAS, in PIK3CA na frekvencah, ki so bile zelo podobne tistim, ki so bile predhodno identificirane v vzorcih biopsije tumorja, statistično so se ujemale s 94% do 99%."

Poleg tega so po podatkih NIH raziskovalci poročali o naslednjem:

"V drugi komponenti študije so raziskovalci ocenili skoraj 400 bolnikov, od katerih je večina imela pljučni ali kolorektalni rak, ki so imeli na voljo rezultate ctDNA v krvi in ​​tumorsko tkivo ter primerjali vzorce genomskih sprememb. biopsija v primerjavi z rezultati analize biopsije tumorja je bila 87%. Točnost se je povečala na 98%, ko so bili vzorci krvi in ​​tumorjev zbrani v 6 mesecih medsebojno.

Guardant360 je bil natančen, čeprav so bile ravni krožeče DNA v krvi nizke. Pogosto je kroženje tumorske DNA sestavljalo le 0,4 odstotka DNK v krvi.

Raziskovalci podjetja Guardant so lahko s pomočjo biopsije tekočine identificirali tumorske označevalce, ki bi lahko zdravljenje zdravili pri 67 odstotkih bolnikov. Ti bolniki so bili upravičeni do zdravljenja, ki ga je odobril FDA, in tudi do preiskovalnih terapij.

ctDNA in pljučni rak

Leta 2016 je FDA odobrila preizkuse mutacij EGFR, ki se uporabljajo za odkrivanje EGFR mutacije v krožeči DNA bolnikov z rakom pljuč. Ta test je bil prva tekočinska biopsija, odobrena s strani FDA, in identificirali bolnike, ki so lahko kandidati za zdravljenje z usmerjenimi terapijami z uporabo erlotiniba (Tarceva), afatiniba (Gilotrif) in gefitiniba (Iressa) kot prvega zdravljenja, in osimeritinib (Tagrisso) kot zdravljenje druge linije. Te ciljne terapije napadajo rakaste celice s specifičnimi EGFR mutacije.

Pomembno je, da zaradi velikega števila lažno negativnih rezultatov FDA priporoča, da se vzorec tkivne biopsije odvzame tudi bolniku, ki ima negativno biopsijo tekočine.

ctDNA in rak jeter

Število ljudi, ki umre zaradi raka na jetrih, se je v zadnjih 20 letih povečalo. Trenutno je rak na jetrih drugi vodilni vzrok smrti zaradi raka na svetu. Ni dobrih biomarkerjev za odkrivanje in analizo jeter ali hepatocelularnega raka. Krožeča DNA bi lahko bila dober biomarker za raka na jetrih.

Razmislite o naslednjem citatu iz Lagbae in soavtorjih o možnosti uporabe krožeče DNA za diagnosticiranje raka na jetrih:

"Hipermetilacija RASSF1A, p15 in p16 je bila predlagana kot zgodnje diagnostično orodje v retrospektivni študiji, ki je vključevala 50 bolnikov s HCC. Podpis štirih nenormalno metiliranih genov (APC, GSTP1, RASSF1A in SFRP1) je bil testiran tudi za diagnostično natančnost Nadaljnje študije so analizirale ctDNA pri bolnikih s HCC z uporabo tehnologij za globinsko sekvenciranje …. Presenetljivo je bilo odkritje nenavadnih številk kopij DNK v dveh HBV nosilcih brez predhodne zgodovine HCC v času odvzema krvi, vendar ki so med spremljanjem razvili HCC. Ta ugotovitev je odprla vrata za ovrednotenje variacije števila kopij v ctDNA kot orodje za presejanje za zgodnje odkrivanje HCC.

Word From DipHealth

Tekoče biopsije so zanimiv nov pristop k genomski diagnozi. Trenutno so nekateri tekoči biopsiji, ki nudijo celovito molekularno profiliranje, na voljo zdravnikom, da dopolnijo genetske informacije, pridobljene z biopsijo tkiva. Obstajajo tudi nekatere tekoče biopsije, ki jih je mogoče uporabiti namesto biopsije tkiva - kadar biopsija tkiva ni na voljo.

Pomembno je, da se zavedate, da trenutno potekajo številna preskušanja s tekočo biopsijo in da je treba opraviti več raziskav, da bi izboljšali terapevtsko koristnost tega posega.